پس از مشاهده تئوری در مورد رنگ ها و لکه ها، قصد داریم به تجزیه و تحلیل لکه های اصلی مورد استفاده در علم میکروبیولوژی و رنگ های تشکیل دهنده آنها بپردازیم.

در این مورد، تکنیک های مختلف رنگ آمیزی مورد تجزیه و تحلیل برای میکروسکوپ نوری استفاده می شود . بیشتر نمونه ها را می توان در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی 20x و 50x مشاهده کرد، اگرچه مواردی وجود دارد که لازم است از بزرگنمایی 100 برابر استفاده شود (جایی که روغن غوطه وری نیز به نمونه اضافه می شود).

لکه های اصلی Gram و Ziehl-Neelsen هستند که هر دو دیفرانسیل هستند. اگرچه سایر لکه های متفاوت و انتخابی مورد علاقه برای میکروبیولوژی نیز وجود دارد.

لکه گرم

لکه گرم احتمالا بهترین شناخته شدست. این از نوع دیفرانسیل است و برای تشخیص میکروارگانیسم ها از نظر مورفولوژی و ترکیب استفاده می کند.

باید در نظر داشت که رنگ‌آمیزی باید زمانی انجام شود که کشت در مرحله نمایی است، زیرا در مرحله ثابت (“پیری”) گرم مثبت ها را می توان با موارد منفی اشتباه گرفت. این به دلیل از بین رفتن لایه های پپتیدوگلیکان توسط باکتری های گرم مثبت رخ می دهد.

رنگ ها

• کریستال بنفش. به باکتری های گرم مثبت رنگ آبی یا بنفش می دهد.
• سافرانین. به باکتری های گرم منفی رنگ قرمز یا نارنجی می دهد.

به غیر از این رنگ ها، در رنگ آمیزی گرم، از لوگول به عنوان رنگ کننده و 96 درصد الکل برای رنگ زدایی استفاده می شود . تمام سلول ها (چه گرم مثبت یا منفی) با کریستال ویولت رنگ آمیزی می شوند.

اکنون الکل فسفولیپیدها را از بین می برد و منافذ دیواره سلولی را می بندد، بنابراین کریستال بنفش به دام می افتد. باکتری های گرم مثبت به لطف لایه پپتیدوگلیکان بزرگ خود قادر به پشتیبانی از این فرآیند خواهند بود. با این حال، باکتری های گرم منفی این درمان با الکل را تحمل نمی کنند، بنابراین کریستال بنفش از آنها حذف می شود. لکه ها و رنگ های اصلی در میکروبیولوژی .
شایدبرایتان جذاب باشد : کتاب باکتری شناسی پزشکی

آماده سازی

فرآیند رنگ آمیزی شامل مراحل زیر است:

1. با حلقه کشت، بارهای مختلف (کلنی ها، سلول های باکتریایی) برداشته شده و روی لام پخش می شود. آب مقطر اضافه نمی شود.
2. فرآیند تثبیت با گرم کردن شعله انجام می شود.
3. کریستال ویولت اضافه می شود و لام را به مدت 2 یا 3 دقیقه با این رنگ می پوشانیم.
4. حالا لوگول (2% یدید پتاسیم + ید) به مدت 1 دقیقه اضافه می شود . لوگول به خودی خود یک رنگ نیست، بلکه بیشتر به عنوان یک ماده رنگزا عمل می کند . ماده خشک با رنگ جفت می شود و جذب آن توسط میکروارگانیسم را تسهیل می کند.
5. اسلاید را با آب مقطر بشویید. آب نباید مستقیماً با نمونه تماس داشته باشد.
6. سفید شده با 96% الکل. الکل قطره قطره اضافه می شود و قطرات ارغوانی از نمونه خارج می شود. وقتی اولین قطره شفاف نمونه ظاهر شد، الکل را متوقف می کنیم.
7. رنگ کنتراست، سافرانین ، به مدت 5 دقیقه اضافه می شود.
8. در نهایت لام شسته و خشک می شود.

آب و برق

کاربرد اصلی رنگ آمیزی گرم تشخیص باکتری های گرم مثبت و منفی است. گرم منفی هایی که به دلیل درمان با الکل رنگ خود را از دست دادند اکنون به دلیل اثر سافرانین قرمز، نارنجی یا صورتی به نظر می رسند. از سوی دیگر، باکتری های گرم مثبت رنگ آمیزی شد با کریستال بنفش رنگ مایل به آبی یا بنفش خواهند داشت.

گرم مثبت

گونه های زیر نماینده ترین گونه های گرم مثبت هستند :

ممکن است مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را از دست بدهید . درست است که یک باکتری گرم مثبت است. با این حال، با لکه گرم به خوبی تشخیص داد نمی شود. لکه دیفرانسیل دیگری مورد نیاز است (لکه زیهل نیلسن) که در ادامه خواهیم دید.

گرم منفی

در زیر تعدادی از رایج ترین باکتری های گرم منفی را مشاهده خواهیم کرد :

یادآوری : باکتری های گرم مثبت رنگ آبی (آبی تیره یا بنفش) دارند، در حالی که باکتری های گرم منفی رنگ قرمز (قرمز، نارنجی یا صورتی) دارند. شاید شما واضح هستید؛ اما در مورد شخصی من تقریباً همیشه آنها را گیج می کردم. به همین دلیل در هر عبارت رنگ مربوطه را قرار دادم تا اگر همان اتفاقی که برای من افتاد برای شما هم بیفتد بهتر آن را به خاطر بسپارید. 😉

لکه Ziehl-Neelsen

لکه Ziehl-Neelsen یک نوع متمایز است و برای شناسایی باکتری های مقاوم به اسید الکل (AFB) استفاده می شود که قابل توجه ترین آنها مایکوباکتریوم توبرکلوزیس است . این بسیار مفید است، به ویژه با توجه به اینکه M. tuberculosis را نمی توان به درستی با رنگ آمیزی گرم تشخیص داد.

چیزی که این باکتری ها را متفاوت می کند وجود یک پلیمر (اسیدهای مایکولیک) است که به قندها متصل می شود که باعث می شود کل دیواره بسیار نفوذناپذیر شود.

رنگ ها

• فوشسین کربوهیدرات. رنگ مایل به قرمز به باکتری AAR می دهد.
• متیلن بلو. به بقیه باکتری هایی که AAR نیستند رنگ مایل به آبی می دهد.

در رنگ‌آمیزی Ziehl-Neelsen، اسید-الکل عملکردی مشابه با الکل 96٪ در رنگ‌آمیزی گرم دارد. در این مورد، کنتراست به دلیل اسیدهای مایکولیک ظاهر می شود که باکتری های آن را نسبت به الکل-اسید غیرقابل نفوذ می کند. باکتری هایی که این اسیدهای مایکولیک را ندارند با اثر الکل تغییر رنگ داده و فوشین از آنها خارج می شود.

آماده سازی

فرآیند رنگ آمیزی شامل مراحل زیر است:

1. با حلقه کشت، بارهای مختلف (کلنی ها، سلول های باکتریایی) برداشت و روی لام پخش می شود. آب مقطر اضافه نمی شود.
2. نمونه با حرارت ثابت می شود.
3. فوشین کربوهیدرات اضافه می شود و لام را به مدت 3 دقیقه کاملاً می پوشاند.
4. بعداً فندک را چند بار به مدت 5 دقیقه اما بدون اینکه اجازه دهید رنگ بجوشد یا خشک شود، رد کنید وگرنه رنگ مصرف می شود.
5. رنگ اضافی با آب مقطر حذف می شود.
6. الکل اسید برای تغییر رنگ به مدت 10 دقیقه در فواصل 1 و نیم دقیقه اضافه می شود.
7. اکنون رنگ کنتراست، متیلن بلو، به مدت 3 دقیقه اضافه می شود.
8. در نهایت لام شسته و در هوا خشک می شود.

آب و برق

عملکرد اصلی رنگ‌آمیزی Ziehl-Neelsen، تشخیص مایکوباکتریوم‌هایی است که باعث ایجاد سل ( M. tuberculosis ) یا جذام ( M. leprae ) می‌شوند. مایکوباکتری‌های دیگری نیز وجود دارند که اگرچه بیماری‌زا نیستند، اما در شرایط خاصی می‌توانند پاتوژن‌های فرصت‌طلب باشند.

علاوه بر این، کورینه‌باکتری‌های مورد علاقه بیوتکنولوژی را می‌توان به دلیل تولید مواد افزودنی یا Streptomyces که آنتی‌بیوتیک‌های مختلفی را تشکیل می‌دهند، شناسایی کرد. نوکاردیا و اکتینومایسس نیز می توانند به عنوان باکتری های اسید فست ظاهر شوند.

سلول های باکتریایی رنگ آمیزی شده با فوشسین قرمز آتشین به نظر می رسند، در حالی که آنهایی که با متیلن آبی رنگ شده اند مایل به آبی به نظر می رسند. لکه ها و رنگ های اصلی در میکروبیولوژی .

لکه Wirtz-Conklin

رنگ آمیزی Wirtz-Conklin برای مشاهده خوب اندوسپورهای باکتریایی استفاده می شود . نمونه باید از یک کشت در فاز ساکن گرفت شود. در این مورد، برای مشاهده زیر میکروسکوپ باید از لنز x100 با استفاده از روغن غوطه وری استفاده کنید.

در گروه لکه های انتخابی قرار می گیرد ، اگرچه با افزودن رنگ کنتراست از نظر فنی یک لکه دیفرانسیل است.

رنگ ها

• مالاکیت سبز. اندوسپورها را سبز رنگ می کند.
• سافرانین . این اختیاری است و برای رنگ کردن بقیه سلول با رنگ نارنجی استفاده می شود.

آماده سازی

فرآیند رنگ آمیزی شامل مراحل زیر است:

1. با حلقه کشت، بارهای مختلف (کلنی ها، سلول های باکتریایی) برداشته میشود و روی لام پخش می شود. آب مقطر اضافه نمی شود.
2. نمونه با حرارت ثابت می شود.
3. مالاکیت سبز اضافه می شود و لام را به مدت 9 دقیقه کاملاً می پوشاند.
4. اکنون حرارت به مدت 3 تا 6 دقیقه اعمال می شود تا رنگ وارد دیواره های اندوسپور شود. حرارت اعمال می شود تا زمانی که انتشار بخار ظاهر شود.
5. لام با آب شسته می شود تا رنگ از سلول خارج شود (به جز آندوسپور).
6. اکنون رنگ کنتراست، سافرانین ، به مدت 5 دقیقه اضافه می شود.
7. در نهایت لام با آب شسته و خشک می شود.

آب و برق

از آن برای مشاهده اندوسپورهای باکتریایی، ساختارهای مقاومتی که برخی باکتری ها برای زنده ماندن در شرایط محیطی شدید که نمی توانند چرخه زندگی عادی خود را انجام دهند، تشکیل می دهند، استفاده می شود. بنابراین، شما می توانید اندوسپورهایی را که باسیلوس آنتراسیس و کلستریدیوم پرفرنجنس را تشکیل می دهند ، مشاهده کنید.

اندوسپورها به دلیل پوشش ضخیم و نفوذ ناپذیری که دارند، بیشتر رنگ ها را جذب نمی کنند. با این حال، مالاشیت سبز می تواند این کار را انجام دهد، بنابراین اندوسپورهای باکتری به رنگ سبز در می آیند در حالی که بقیه سلول های باکتری رنگ صورتی خواهند داشت.

لکه لیفسون

لکه لیفسون برای مشاهده تاژک های باکتریایی استفاده می شود . در رنگ آمیزی انتخابی قرار می گیرد . ضخامت آنها 0.01 میکرون است، بنابراین برای میکروسکوپ نوری نامرئی هستند. به همین دلیل است که این تکنیک خاص مورد نیاز است. برای مشاهده در میکروسکوپ نوری باید از روغن غوطه وری و بزرگنمایی 100 برابر استفاده شود.

ما بر این واقعیت تأکید می کنیم که از این لکه برای دیدن تاژک های باکتریایی استفاده می شود. تاژک‌های موجودات یوکاریوتی ضخیم‌تر هستند و با لکه‌های ساده یا حتی با آماده‌سازی نقاشی‌های دیواری رویت می‌شوند.

رنگ ها

از لکه لیفسون استفاده می شود که از موارد زیر تشکیل شدست:

• فوشین پایه 95%. این خود رنگ آمیزی است.
• اتانول 1.2 درصد
• تانیک اسید 3 درصد این یک عملکرد مرگبار دارد.
• کلرید سدیم 1.5٪.
• آب مقطر. همراه با اسید تانیک و کلرید سدیم ظاهر می شود و بخشی از محلول های آنها را تشکیل می دهد.

ساختارهای لکه دار به رنگ قرمز به نظر می رسند.

آماده سازی

فرآیند رنگ آمیزی شامل مراحل زیر است:

1. با حلقه کشت، بارهای مختلف (کلنی ها، سلول های باکتریایی) برداشته شده و روی لام پخش می شود. آب مقطر اضافه نمی شود. (دایره ای باید قبلا روی اسلاید ساخته شد باشد).
2. فرآیند تثبیت بدون شعله به مدت 5 دقیقه انجام می شود. از فندک استفاده نمی شود زیرا گرمای بیش از حد می تواند تاژک ها را از بین ببرد.
3. چند قطره از لکه لیفسون را اضافه کنید و 15 دقیقه صبر کنید.
4. اکنون لام با آب مقطر شسته شده و خشک می شود.

آب و برق

از این لکه برای دیدن تاژک استفاده می شود که برای شناسایی بسیاری از گونه ها ضروری است. و تاژک‌ها می‌توانند در تعداد و آرایش‌های مختلف در باکتری‌ها ظاهر شوند، از این رو راهی برای طبقه‌بندی آن‌ها هستند

لکه گیمسا

این رنگ بیشتر در سیتولوژی استفاده می شود، زیرا می تواند بین نواحی با محتوای DNA بالا تمایز قائل شود، بنابراین می تواند اندامک های مختلف سلول را متمایز کند. این یک لکه دیفرانسیل است. با این حال، در میکروبیولوژی برای تشخیص باکتری های خاص، به ویژه ریکتزیا نیز استفاده می شود .

رنگ ها

لکه گیمسا. رنگ آبی یا بنفش تیره به میکروارگانیسم مورد نظر می دهد.

آماده سازی

فرآیند رنگ آمیزی شامل مراحل زیر است:

1. با حلقه کشت، بارهای مختلف (کلنی ها، سلول های باکتریایی) برداشته شده و روی لام پخش می شود.
2. فرآیند تثبیت با متانول به مدت 3 یا 5 دقیقه انجام می شود.
3. مقداری لکه گیمسا اضافه کنید و 8 دقیقه صبر کنید.
4. اکنون لام با آب مقطر شسته شده و خشک می شود.

آب و برق

در میکروبیولوژی، لکه گیمسا باکتری هایی مانند ریکتزیا و کلامیدیا ، پروتیست هایی مانند پلاسمودیوم و پنوموسیستیس و قارچ های خاصی مانند هیستوپلاسما را شناسایی می کند . این میکروارگانیسم ها در سلول های آلوده احتمالی شناسایی می شوند.

پاتوژن مهم دیگری که لکه گیمسا تشخیص می دهد هلیکوباکتر پیلوری است که باعث گاستریت و زخم می شود.

البته این لکه بیشتر در سیتولوژی استفاده می شود.

رنگ آمیزی منفی

برای تشخیص کپسول هایی که در برخی باکتری ها ظاهر می شوند استفاده می شود، بنابراین در گروه لکه های انتخابی قرار می گیرد . رنگ آمیزی منفی می تواند برای میکروسکوپ نوری یا میکروسکوپ الکترونی استفاده شود.

این تکنیک بر اساس کنتراست نمونه ها با استفاده از یک ماده مات در هر دو میکروسکوپ است. در حال حاضر، برای میکروسکوپ نوری، نمونه با فوتون ها در تضاد است، در حالی که در میکروسکوپ الکترونی، نمونه با الکترون ها در تضاد است. لکه ها و رنگ های اصلی در میکروبیولوژی .

رنگ ها

برای میکروسکوپ نوری، به طور عمده می تواند دو مورد وجود داشته باشد:

• جوهر هندی.
• نیگروسین.

پس زمینه را سیاه می کنند.

آماده سازی

فرآیند رنگ آمیزی شامل مراحل زیر است:

1. آماده سازی تازه از نمونه ساخته شده است.
2. اکنون جوهر هند اضافه شده است .
3. از قبل قابل مشاهده است

بله، از بین تمام لکه ها، این کوتاه ترین فرآیندی است که دیده ایم.

آب و برق

عملکرد اصلی رنگ‌آمیزی منفی مشاهده کپسول‌های باکتریایی است. این به این دلیل رخ می دهد که کپسول ها جوهر هند را جذب نمی کنند، بنابراین این ساختارها به صورت مناطق روشن در یک زمینه تیره و سیاه ظاهر می شوند.

اکنون می‌توانید مقداری رنگ کنتراست اضافه کنید تا سلول‌های باکتریایی بیشتر دیده شوند. و همانطور که قبلاً گفتیم می توان از nigrosine به جای جوهر هند استفاده کرد.

موارد بیشتر : قارچ سیاه یا موکورمایکوزیس